Une nouvelle méthode permet la détection de l’ARN avec les nucléases Cas12

Les systèmes CRISPR-Cas, systèmes de défense des bactéries, sont devenus une riche source de technologies de diagnostic moléculaire. Les chercheurs de l’Institut Helmholtz de recherche sur les infections à ARN (HIRI) à Würzburg ont élargi cette vaste boîte à outils. Leur nouvelle méthode, appelée PUMA, permet la détection de l’ARN à l’aide des nucléases Cas12, qui ciblent naturellement l’ADN. PUMA promet une large gamme d’utilisations et une grande précision. L’équipe a publié ses résultats dans la revue Nature Communications.

Les bactéries ont développé des mécanismes de défense spéciaux pour se protéger contre les virus qui ne touchent en aucun cas uniquement les humains. Dans le cadre de ces systèmes dits CRISPR-Cas, un acide ribonucléique CRISPR (ARNcr), qui sert d’« ARN guide », reconnaît les zones d’un génome étranger, comme l’ADN viral.

La nucléase (Cas) associée à CRISPR, contrôlée par un crRNA, la rend ensuite inoffensive en la coupant comme des ciseaux. Les humains ont profité de cette stratégie : « CRISPR, souvent appelé « ciseaux génétiques », est la base de nombreuses technologies moléculaires », explique Chase Beisel, chef du département de biologie synthétique de l’ARN à l’Institut Helmholtz pour la recherche sur les infections à base d’ARN. (HIRI). ) à Wurtzbourg. L’institut est un siège du Centre Braunschweig Helmholtz pour la recherche sur les infections (HZI) en coopération avec l’Université Julius Maximilians (JMU) de Würzburg, où Beisel est titulaire d’une chaire.

La plateforme de diagnostic LEOPARD, développée par le laboratoire de Beisel en collaboration avec le JMU en 2021, utilise également CRISPR comme technologie. LEOPARD a le potentiel de détecter une variété de biomarqueurs liés à la maladie en un seul test. L’approche est basée sur la reprogrammation de facteurs d’ARN, appelés tracrRNA. Ces ARN sont naturellement impliqués dans la production d’ARN guides utilisés par Cas9 et diverses nucléases Cas12.

LEOPARD s’est concentré sur Cas9. Cependant, les systèmes CRISPR-Cas incluent également un autre ensemble diversifié de nucléases, appelé Cas12.

Chase Beisel, chef du département de biologie synthétique de l’ARN à l’Institut Helmholtz pour la recherche sur les infections à base d’ARN (HIRI), Würzburg

Alors que Cas9 et Cas12 coupent les cibles d’ADN, Cas12 peut augmenter le signal de sortie en coupant l’ADN « collatéral ». Cela permet aux technologies de détection de devenir plus sensibles et donc plus efficaces.

L’équipe de Chase Beisel a désormais étendu les fonctions uniques de LEOPARD à Cas12. Les chercheurs ont nommé la méthode résultante PUMA (P.tracerARN programmables Unlock adjacent au protospacer MDétection indépendante de l’Otif des acides ribonucléiques UNcids par les nucléases Cas12). Les détails de leurs découvertes font l’objet d’un article dans la revue Communication naturelle.

surmonter les obstacles

Bien que les nucléases Cas12 soient largement utilisées dans le diagnostic moléculaire, deux limitations clés demeurent : les technologies basées sur Cas12 sont limitées aux cibles ADN et à une séquence de reconnaissance spécifique appelée PAM (abréviation de). Motif adjacent au protospacerest nécessaire pour identifier la molécule cible.

PUMA relève ces défis avec élégance. Comme LEOPARD, cette nouvelle méthode s’appuie également sur les tracrRNAs. « Avec PUMA, nous pouvons reprogrammer les tracrRNA. Cela nous permet de décider quel biomarqueur ARN devient l’ARN guide. Cet ARN guide guide à son tour Cas12 vers une molécule d’ADN que nous fournissons et active les ciseaux génétiques », explique le premier auteur de l’étude : Chunlei Jiao. Chunlei Jiao, ancien étudiant diplômé et boursier postdoctoral du laboratoire Beisel, a également participé au développement de LEOPARD. Il a récemment accepté un poste de professeur à l’Université nationale de Singapour. “La coupe de l’ADN nous indique alors quel biomarqueur était présent dans l’échantillon, par exemple des biomarqueurs spécifiques de différents agents pathogènes”, ajoute Beisel.

La nouvelle méthode permet donc la détection de biomarqueurs d’ARN à l’aide de nucléases CRISPR, qui ne peuvent normalement reconnaître que l’ADN. « Ceci est particulièrement important pour les biomarqueurs moléculaires qui ne peuvent être trouvés qu’au niveau de l’ARN. Il s’agit par exemple des virus à ARN », explique Beisel. PUMA ne nécessite pas de séquence de reconnaissance spécifique : le PAM est contenu dans la molécule cible d’ADN fournie. À mesure que les chercheurs fournissent la molécule cible, ils peuvent également introduire de l’ADN tronqué. Cela leur a permis d’augmenter considérablement la vitesse de la méthode.

Faire d’une pierre plusieurs coups

“PUMA a le potentiel de devenir un outil flexible et précis pour la détection de l’ARN”, conclut Beisel. Enfin, l’équipe a démontré le potentiel de la méthode en identifiant cinq agents pathogènes bactériens associés au sepsis aigu. Leur détection reposait sur un seul tracrRNA universel et reprogrammé, qui fournit un moyen simplifié de distinguer les différentes espèces bactériennes. Cela ouvre un large éventail d’applications possibles en médecine : « La nouvelle technologie représente une nouvelle forme de diagnostic CRISPR qui permet des tests moléculaires fiables sur le lieu d’intervention, qu’il s’agisse d’identifier des agents pathogènes viraux ou bactériens ou de détecter des biomarqueurs du cancer », explique-t-il. Jiao.

L’équipe de recherche planifie déjà les prochaines étapes : « Notre objectif est d’obtenir une lecture multiplexée similaire à LEOPARD et d’élargir la gamme d’utilisations de la technologie », déclare Beisel, qui s’attend également à une utilisation généralisée dans la communauté des chercheurs : « Nous espérons que “Notre étude stimulera la poursuite des recherches sur la reprogrammation des tracrRNA.”