Dans une étude récente publiée dans Génétique naturelleLes chercheurs ont effectué une édition génomique à saturation (SGE) du gène de la protéine 1 associé à BRCA1 (BAP1), dont le dysfonctionnement est lié au cancer et à un développement neurologique altéré.

Étude : La modification du génome par saturation de BAP1 classe fonctionnellement les variantes somatiques et germinales.  Source de l’image : Milliard de photos/Shutterstock.com
Étude: En modifiant le génome de saturation de BAP1, les variantes somatiques et germinales sont fonctionnellement classées. Source de l’image : Milliard de photos/Shutterstock.com

arrière-plan

Les mutations héréditaires avec perte de fonction (LOF) du gène BAP1 entraînent une susceptibilité aux tumeurs, dont certaines sont associées à des problèmes de développement neurologique. Des variantes de signification inconnue conduisent à un syndrome de prédisposition tumorale autosomique dominante, qui entraîne des complications pendant le traitement du patient.

Les critères de dépistage actuels des individus présentant des mutations germinales pathogènes dans BAP1 sont essentiels pour identifier les groupes à risque et améliorer les recommandations en matière de surveillance. L’identification de mutations somatiques de type perturbatrices de BAP1 dans les tumeurs malignes peut aider à adapter le traitement du cancer.

À propos de l’étude

Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé SGE pour caractériser les variations d’un seul nucléotide du gène BAP1 afin d’améliorer les efforts de médecine de précision.

Les chercheurs se sont concentrés sur l’étude des variations de signification inconnue (VUS) du gène BAP1, qui sont essentielles au traitement des patients. Ils ont examiné le rôle des polymorphismes germinaux et somatiques BAP1 dans la propension aux tumeurs et ont ciblé les thérapies oncologiques. Ils ont examiné les corrélations entre les variations de BAP1 et des cancers tels que le mélanome cutané, le mélanome uvéal, le cholangiocarcinome, le mésothéliome, le méningiome et le cancer du rein.

Les chercheurs ont mené des expériences avec 18 108 variantes différentes, dont 6 196 avaient des fonctionnalités différentes. Ils ont ensuite utilisé ces résultats pour évaluer les relations phénotypiques dans la biobanque britannique, une collection de tumeurs basée sur la population, les arbres généalogiques du cancer et ClinVar.

Les chercheurs ont développé une souche knock-out (KO) HAP1 ADN ligase 4 (LIG4) qui comprenait l’intégration génomique d’un Cas9 modifié par clonage (HAP1-A5). Ils ont affiné les plasmides et les méthodes de transfection et criblé tous les exons codant pour BAP1 sur cinq périodes. De plus, ils ont mené deux études différentes pour cibler chaque domaine SGE.

La condition physique cellulaire a été utilisée comme indicateur biologique de la fonction BAP1 et a démontré son importance et l’efficacité du SGE dans les cellules HAP1. Un criblage ciblé, regroupé et régulièrement espacé de courtes répétitions palindromiques associées à la protéine 9 (CRISPR-Cas9) a été réalisé, avec 193 sgARN et bibliothèques de variantes réparties dans les 22 régions cibles BAP1.

Les chercheurs ont mené des analyses fonctionnelles de l’architecture et de la conservation des gènes et ont classé les variations en catégories fonctionnelles. Les variantes avec un taux de fausses découvertes (FDR) ≥ 0,01 ont été classées comme inchangées, tandis que les variantes avec un FDR ≤ 0,01 et un score fonctionnel négatif ont été classées comme épuisées. Les variantes avec un FDR ≤ 0,01 et un score fonctionnel positif ont été classées comme enrichies. Les chercheurs ont comparé cette mesure avec les résultats du SGE et ont testé la fiabilité des scores fonctionnels et des classifications pour chaque variante en comparant les changements log2 fois (LFC) issus de différentes études d’édition du génome.

Les chercheurs ont comparé le test BAP1-SGE au cadre de preuves de l’American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) pour déterminer son utilité pour l’interprétation des variantes. Ils ont examiné les variantes de BAP1 dans le cancer et le développement neurologique et les ont classées comme gravement déficientes ou légèrement épuisées. Ils ont utilisé une étude d’association à l’échelle du phénomène (PheWAS) pour identifier les variantes déficientes et développé des caractéristiques phénotypiques du type de cancer ainsi que des masques de test pour le fardeau des variantes rares.

Ils ont également examiné l’association entre les mutations BAP1 de la UK Biobank et les aspects quantitatifs de l’uvée. Mélanome en utilisant les données de séquençage de l’acide ribonucléique (RNA-seq) du Cancer Genome Atlas. Ils ont également examiné les données de séquençage des tumeurs provenant de 394 756 échantillons de patients dans la base de données Foundation Medicine pour identifier de nouvelles variantes de BAP1.

Résultats

Des mutations germinales perturbatrices de BAP1 de type non synonyme ont été associées à des diagnostics de cancer et à des taux élevés de facteur de croissance analogue à l’insuline 1 (IGF-1), suggérant un mécanisme pathogène possible et une cible thérapeutique. Le score fonctionnel a classé avec précision les variantes avec une sensibilité >99 % et une spécificité >98 % et une valeur d’aire sous la courbe (AUC) >0,999.

La méthode SGE révisée a augmenté la qualité de l’expérience en établissant le caractère essentiel de BAP1 dans la lignée cellulaire HAP1-LIG4-KO, en augmentant l’activité Cas9 et en maintenant une haploïdie robuste. La méthode SGE raffinée a amélioré l’efficacité de la transfection entre les cellules HAP1 de moins de 5,0 % à plus de 60 %. Le caractère essentiel de BAP1 a permis la séparation des conséquences mutationnelles, les variantes stop-gain et frameshift présentant des valeurs fonctionnelles principalement négatives.

Les variations faux-sens et les délétions de codons ont abouti à des résultats avec une distribution bimodale, permettant aux chercheurs d’identifier les résidus et domaines critiques de la protéine BAP1. Sur les 18 108 variantes de BAP1, 11 912 étaient constantes, 5 665 étaient épuisées et 531 étaient enrichies. Les variantes non modifiées n’ont pas reçu d’évaluations fonctionnelles, mais les variantes enrichies ont obtenu de meilleurs résultats. L’équipe a observé que certaines variantes synonymes étaient épuisées à l’écran. Les variantes avec un type synonyme présentaient des valeurs SpliceAI significativement plus élevées que les variantes synonymes inchangées. Les versions épuisées ont une plage d’évaluation plus large.

Le domaine UCH N-terminal conservé de BAP1 était plus résistant aux mutations faux-sens et aux délétions de codons. Les classifications fonctionnelles calculées à l’aide des LFC et des FDR de la bibliothèque A ou B ont donné un accord de 90 % dans la classification des variantes. Les chercheurs ont découvert que 99,8 % des variations dans l’ensemble de vérités sur la pathogénicité s’attendaient à un épuisement, tandis que 97 % étaient inchangées ou enrichies. La classification fonctionnelle des tests et du SGE est assez similaire et permet l’identification simultanée d’un hypomorphe probable.

Diplôme

L’étude a démontré qu’une évaluation fonctionnelle complète des loci à l’aide de SGE peut améliorer le diagnostic du patient, la compréhension biologique des causes de la maladie et la compréhension fondamentale de la fonction des gènes et des protéines.



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